کروماتوگرافی مایع با عملکرد زیاد (HPLC)

کروماتوگرافی HPLC، نوعی کروماتوگرافی ستونی است، زیرا تفکیک اجزای نمونه در یک ستون که از آن فاز متحرک مایع عبور می­ کند انجام می­ شود. اگرچه روش قدیمی و ساده کروماتوگرافی ستونی هنوز هم استفاده می­ شود، اما روش HPLC که کروماتوگرافی مایع با سرعت زیاد (HSLC) نیز نامیده می‌شود، به‌صورت روشی استاندارد برای جداسازی با ستون در آمده است. اساس این روش با روش معمولی ستونی تفاوتی ندارد، بلکه فقط از نظر دستگاه و روش عمل تفاوت­ هایی وجود دارد. مزایای عمده HPLC نسبت به LC معمولی سرعت، قدرت تفکیک، حساسیت زیاد آن و سهولت کار برای تجزیه‌های کمّی است. در روش HPLC پمپ­ های پرفشار با برنامه‌نویس ­های الکترونیکی، ستون­ های پرشده با ذرات ریز، با قطرهایی در مقیاس میکرومتر، و آشکارسازهای بسیار حساس، موردنیاز است.

دستگاه HPLC

یک دستگاه HPLC (شکل ۱) به ­طور اساسی شامل یک ستون به طول حدود ۲۵ سانتی­متر و قطر داخلی حدود ۴/۶ میلی­متر است که با یک فاز ساکن مناسب پر شده است. ماده پر شده درون این ستون، اغلب اکتادسیل (ODS) است، که دارای زنجیره هیدروکربنی C18 متصل به ذرات سیلیس با قطر ۵ – μm10 است. از درون این ستون فاز متحرک عبور می­ کند که مواد موجود در نمونه را انتقال داده و به انتهای ستون می ­رساند. فاز متحرک می­ تواند مخلوطی از آب و یک حلال آلی، اغلب متانول یا استونیتریل، باشد، که با استفاده از یک پمپ پیستونی یا یک پمپ جبران کننده، با سرعت یک میلی­ لیتر بر دقیقه، پمپ می­ شود. ستون درون یک کوره که دمای آن در حدود ۳۰ درجه سانتیگراد  نگه­ داشته می­ شود، قرار دارد.

حجم حدود ۱۰ الی ۲ میکرولیتر نمونه توسط یک سرنگ مخصوص (نوک این سرنگ مانند نوک سرنگ GC سوزنی و تیز نیست)، از طریق یک لوپ با حجم ثابت که به یک شیر تزریق شش دریچه­ای (شکل ۲) متصل است، به درون ستون تزریق و بعد از تفکیک اجزا، آشکارسازی می­ شود.

شکل ۱٫ طرح ­واره­ ای از یک کروماتوگراف مایع با عملکرد زیاد.

رایج­ترین آشکارساز مورد استفاده برای دستگاه HPLC، طیف­ نورسنج فرابنفش- مرئی، اغلب به صورت یک واحد تک طول­ موج یا با آرایه فوتودیودی، برای آشکارسازی چند طول ­موجی، است. علاوه براین آشکارساز، آشکارسازهای بسیار ویژه­ مانند فلوئورسانس، الکتروشیمیایی، ضریب شکست، پراکندگی نور یا نورتابی شیمیایی، نیز موجود است. اخیراً از طیف­سنج جرمی به ­عنوان  آشکارساز  در HPLC استفاده می ­شود، که منجر به ساخت دستگاه HPLC-MS شده است. با استفاده از این آشکارساز عمومی، امکان تفسیر طیف جرمی مواد ناشناخته به­ خوبی وجود دارد.

شکل ۲٫ طرح­ واره ­ای از یک شیر تزریق مورد استفاده در HPLC،

(الف) موقعیت بارگذاری و (ب) موقعیت تزریق.

آشکارسازهای HPLC

آشکارسازهای جذبی فرا­بنفش- مرئی: در این آشکارساز، منبع نور یک لامپ بخار جیوه با فشار کم، با یک خط نشری قوی در ۲۵۴ نانومتر است. باریکه تابش نشر شده از این لامپ، توسط یک عدسی کوارتز موازی می‌شود و از سلول­ های شاهد و نمونه عبور می‌کند. سپس از یک صافی عبور داده می‌شود تا پرتوهای غیر لازم، حذف شود. آنگاه نور اصلاح­ شده توسط یک فوتوسل دوتایی یا فوتودیود تشخیص داده می‌شود. معمولاً، یک سلول جریان دائمی از این نوع دارای قطر یک میلی­متر و طول ۱۰ میلی­متر و حجم ۸ میکرولیتر است.

پیشرفته‌ترین و گران­ترین آشکارسازهای فرا­بنفش- مرئی آن­هایی است که از آرایه فوتودیودها استفاده می‌کند و طیف پیوسته و کاملی از مایعات خروجی از ستون LC می‌دهد. برای آشکارسازهای جذبی قوانین عادی طیف­ نورسنجی صدق می‌کند و بین مقدار جذب و غلظت رابطه خطی وجود دارد. آشکارسازهای فرا­بنفش جدید در شرایط مناسب می‌تواند جذب­ هایی با تفاوت ۰/۰۰۰۰۱ واحد جذب (A) را که معادل کسری از ppb است، از یکدیگر تشخیص دهد.

آشکارسازهای فلوئورسانس: طرح این آشکارسازهای، مانند فلوئورسانس سنج­ها و طیف ­نورسنج­ های فلوئورسانس، است. در این نوع از آشکارسازها، از فوتولوله ­ها که در زاویه ۹۰ درجه نسبت به پرتو تحریک کننده قرار دارد، استفاده می­ شود. ساده­ ترین نوع این آشکارسازها، دارای یک لامپ بخار جیوه به­ عنوان منبع برانگیختگی و یک یا چند صافی برای تفکیک نواری از تابش نشر شده است. سیستم ­های پیچیده ­تر براساس منبع زنون بناشده و یک تکفام­ساز شبکه ­ای برای مشخص کردن تابش فلوئورسانس به ­کار گرفته می­ شود. امتیاز ذاتی روش­ های فلوئورسانس، حساسیت زیاد آن­ها است، که نوعاً ده الی صد برابر بهتر از سایر روش­های جذبی است. آشکارساز فلوئورسانس به قدری ویژه و حساس است که مقدار کمی LSD، تا حدود ۹ پیکوگرم، را بدون نیاز به تخلیص و کارهای مقدماتی دیگر تشخیص می‌دهد. این امتیاز در کروماتوگرافی مایع برای جداسازی و اندازه ­گیری اجزای یک نمونه که نور فلوئورسانس نشر می­ کنند، به­ کار گرفته می­ شوند.

آشکارسازهای الکتروشیمیایی: چندین نوع آشکارساز الکتروشیمیایی از طرف سازندگان تجهیزات دستگاهی در دسترس قرار گرفته است. این  وسایل بر اساس سه روش ولتامتری، کولن­ سنجی و رسانایی­ سنجی بناشده­ اند.

در آشکارسازهای ولتامتری، با اعمال پتانسیل الکتریکی به آشکارساز، گروه­های عاملی موجود در اجزای نمونه اکسید یا کاهش می­ یابند و در نتیجه، جریان الکتریکی ایجاد می­ شود. با ثبت جریان الکتریکی ایجاد شده برحسب زمان یا حجم بازداری، کروماتوگرام حاصل می ­شود، که از طریق آن نوع و مقدار اجزای نمونه تعیین می­ شود.

در آشکارسازهای کولن­ سنجی نیز در اثر واکنش ­های اکسایش یا کاهش، مقدار الکتریسیته عبور کرده (برحسب واحد کولن) اندازه­ گیری و در نتیجه کروماتوگرام رسم می­ شود. در آشکارسازهای رساناسنجی، مواد خارج شده از ستون یا یونی هستند و یا به­ طریق مناسبی به یون (کاتیون و آنیون) تبدیل می­ شوند. چون رسانایی الکتریکی یک محلول، به نوع و تعداد یون­های موجود در آن بستگی دارد، ار رسم تغییرات رسانایی الکتریکی برحسب زمان یا حجم بازداری، کروماتوگرام حاصل می­ شود. این نوع آشکارساز، در کروماتوگرافی یونی (IC) که برای تجزیه عنصری آب­ها و نمونه­ های زمین­ شیمیایی کاربرد زیادی دارد، بسیار رایج است.

آشکارسازهای الکتروشیمیایی، به‌خاطر کاربردی که در تجزیه مقادیر کم ترکیبات آلی و معدنی در آب یا مایعات موجود در بدن دارد بسیار متداول شده‌ است. در تمام این روش­ها ترکیبی از آشکارسازها و سلول­ های الکتروشیمیایی جریان دائمی با حجم حدود میکرولیتر به‌کار می‌رود.

آشکارسازهای طیف‌سنجی جرمی: دستگاه طیف­سنج جرمی را به­ عنوان آشکارساز به دستگاه­های GC و HPLC وصل کرده و در نتیجه، به ترتیب دستگاه­های پرقدرتی مانند GC-MS و HPLC-MS حاصل شده است. مشکل اصلی برای جفت کردن کروماتوگرافی مایع با طیف­ سنج جرمی، عدم انطباق حجم­های نسبتاً زیاد حلال در کروماتوگرافی مایع و شرایط خلاء در طیف­ سنج جرمی بود. ولی با ارائه چندین وسیله فصل مشترک، این مشکل حل شده است. در یکی از این وسیله ها که به­ طور تجاری در دسترس است، شوینده خارج شده از ستون تقسیم شده و کسر بسیار کوچکی از آن وارد طیف ­سنج جرمی می­ شود. یکی از جدیدترین فصل مشترک­ها که سیستم کروماتوگرافی را به طیف سنج جرمی وصل می ­کند، افشانه گرمایی است. این وسیله هدایت مستقیم کل سیال خروجی از ستون را با سرعت حدود ۲ میلی­ لیتر بر دقیقه، به درون طیف ­سنج جرمی انجام می ­دهد. در نتیجه، سیال همان­ طور که از داخل یک ستون موئینه گرم شده عبور می ­کند، تبخیر شده و فواره ­ای از آنالیت و حلال تولید می­ شود. بنابراین، افشانه گرمایی نه ­تنها یک فصل مشترک است، بلکه یک منبع یونش نیز است. اجزای خروجی از ستون کروماتوگرافی به ترتیب وارد طیف ­سنج جرمی شده و از طریق طیف­ جرمی آن­ها، شناسایی و اندازه­ گیری می­ شوند.

دستگاه HPLC مدل Infinity II 1290 ساخت شرکت آجیلنت.

دستگاه HPLC مدل Infinity II 1260 ساخت شرکت آجیلنت.

سیستم Alliance HPLC ساخت شرکت واترز.