اندازه گیری نیترات و نیتریت در مواد غذایی به روش اسپکتروفتومتری

اندازه گیری نیترات و نیتریت در مواد غذایی به روش اسپکتروفتومتری (Spectrophotometry)

استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (Spectrophotometer) یا بیناب سنج، برای اندازه ‏گیری نیتریت و نیترات در انواع میوه، سبزیجات و فرآورده ‏های حاصل از آنها، به عنوان یک روش استاندارد رایج است.

1. اندازه گیری نیتریت

اصول کار برای اندازه گیری نیتریت به این قرار است که ابتدا نمونه با آب داغ استخراج شده، سپس، با افزایش محلول‏ های پتاسیم هگزاسیانوفرات و استات روی، پروتئین ها رسوب داده شده و با صاف کردن سیستم، محلول شفاف به دست می آید. با افزودن سولفانیل آمید کلرید (Sulfanilamid chloride) و ان- (۱- نفتیل) اتیلن دی آمین دی هیدروکلرید (Ethylene Diamine Dihydrochloride (Naphthyl -1) -N ) به محلول صاف شده کمپلکس قرمز رنگی ایجاد می شود که با اندازه گیری جذب آن در طول موج ۵۳۸ نانومتر با اسپکتروفتومتر، مقدار نیتریت برآورد می شود.

۲-۱٫ وسایل لازم

تمام وسایل شیشه ای باید کاملاً با آب مقطر یا آب یون زدایی شده به خوبی شسته و تمیز شوند تا از عدم وجود نیتریت و نیترات  اطمینان حاصل شود.

• بالن‏ ژوژه ۵۰ و ۲۰۰ میلی لیتری
• بشرهای ۲۰۰ میلی لیتری
• پی پت های زوژه ۱، ۲، ۳، ۵ و ۱۰ میلی لیتری
• کاغذ صافی بدون خاکستر
• ارلن مایرهای ۲۵ میلی لیتری با درهای سمباده‏ای
• حمام آب جوش
• اسپاتول با نوک تفلون پوش شده.
• هم زن شیشه‏ای با نوک تفلون پوشیده شده.
• اسپکتروفتومتر تک پرتوی یا دوپرتویی، مناسب برای اندازه‏گیری در طول موج ۵۳۸ نانومتر مجهز به کووت یک سانتیمتری.
• ترازوی آزمایشگاهی

۳-۱٫ مواد لازم ( واکنشگرها )

تمامی واکنشگرها باید دارای خلوص آزمایشگاهی بوده و برای تهیه محلول آنها باید ازآب مقطر و یا یون زدایی شده استفاده شود.

۱-۳-۱٫ محلول پتاسیم هگزاسیانو فرات (K₄Fe(CN)₆.3H₂O): مقدار ۱۰۶ گرم پتاسیم هگزاسیانوفرات سه آبه در یک بالن ژوژه ۱۰۰۰ میلی لیتری ریخته شده و پس از انحلال در آب مقطر، تا خط نشانه به حجم رسانده می شود.

۱-۳-۲٫ محلول استات روی: مقدار ۲۲۰ گرم استات روی دو ابه (Zn(CH₃COOH)₂.2H₂O) در مخلوطی از آب و ۳۰ میلی لیتر اسید استیک گلاسیال حل شده و در یک بالن ژوژه ۱۰۰۰ میلی لیتری با آب مقطربه حجم رسانده می شود.

۱-۳-۳٫ محلول ایجاد کننده کمپلکس رنگی: این محلول از مخلوط کردن محلول های A و B درست می شود. محلول های A و B را می‏توان تا یک هفته در شیشه‏های قهوه‏ای تیره با درب کاملاً در بسته نگهداری کرد.

• محلول A: مقدار ۰٫۴ گرم سولفانیل آمید کلرید (Sulfanilamid chloride) در یک بالن ژوژه ۲۰۰ میلی لیتری منتقل شده و با کمک حرارت دادن در حمام آب جوش در ۱۶۰ میلی لیتر آب مقطر حل شده و پس سرد شدن، در صورت لزوم صاف شده و ضمن بهم زدن، مقدار ۲۰ میلی لیتر اسید کلریدریک با دانسیته ۱٫۱۹ گرم بر میلی لیتر، به آن افزوده و با آب مقطر به حجم رسانده می شود.
• محلول B: مقدار ۰٫۱ گرم ان- (۱- نفتیل) اتیلن دی آمین دی هیدروکلرید (Ethylene Diamine Dihydrochloride (Naphthyl -1) -N ) در یک بالن ژوژه ۱۰۰ میلی لیتری ریخته شده و با آب مقطر حل شده و سپس به حجم رسانده می شود.
• محلول C: در یک بالن ژوژه ۱۰۰۰ میلی لیتری ۴۴۵ میلی لیتر اسید کلریدریک با دانسیته ۱٫۱۹ گرم بر میلی لیتر ریخته شده و با آب مقطر به حجم رسانده می شود.

۱-۳-۴٫ محلول اشباع دی سدیم تترابورات ۱۰ آبه یا بوراکس (Na₂B₄O₇.10H₂O): مقدار ۵۰ گرم دی سدیم تترابورات ۱۰آبه یا بوراکس در ۱۰۰۰ میلی لیتر آب نیم گرم حل شده و در کناری قرار داده می شود تا به دمای محیط خنک شود.

۱-۳-۵٫ محلول استاندارد نیتریت سدیم (NaNO₂): مقدار ۳ گرم نیتریت سدیم که قبلاً در دمای ۵ ± ۱۱۵ درجه سانتیگراد خشک و به وزن ثابت رسیده است با تقریب ۱ میلی گرم وزن شده و در ۵۰ میلی لیتر آب مقطرحل شده و به یک بالن ژوژه ۱۰۰۰ میلی لیتری منتقل شده و به حجم رسانده می شود. با یک پیپت ژوژه ۵ میلی لیتر از این محلول به بالن ژوژه ۱۰۰۰ میلی لیتری منتقل شده و به حجم رسانده می شود. یک میلی لیتر از این محلول استاندارد، دارای ۱۰ میکروگرم یون نیتریت (NO₂¯) است. این محلول ناپایدار است و باید در هنگام کاربرد تهیه شود.

  ۴-۱٫ روش کار

۱-۴-۱ آماده سازی نمونه آزمایشی: نمونه آزمایشگاهی باید به خوبی مخلوط و یکنواخت شده اگر نیاز باشد ابتدا هسته‏ها و پوست سخت دانه‏ها خارج شده و نمونه آزمایشگاهی در یک آسیاب مکانیکی سائیده شود. فرآورده منجمد در ظرف در بسته قرار داده شده تا از انجماد خارج شود و مایع تراوش شده با آن مخلوط و به خوبی یکنواخت می شود.

۲-۴-۱٫ نمونه مورد آزمایش: توسط پیپت تا ۱۰ میلی لیتر و یا توسط ترازو ۱ تا ۱۰ گرم از نمونه آماده شده در فوق، متناسب با مقدار نیتریت مورد انتظار در نمونه به دقت برداشته می شود.

۳-۴-۱ تهیه محلول صاف شده: نمونه آماده شده در بند ۱-۴-۲ در یک بشر ۲۰۰ میلی لیتری منتقل شده و به آن ۵ میلی لیتر محلول دی سدیم تترابورات ۱۰ آبه و ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر با دمای ۷۰ الی ۸۰ درجه سانتیگراد افزوده شده و بشر به مدت ۱۵ دقیقه، در حالیکه گاه گاهی تکان داده می شود، در حمام آب جوش حرارت داده می شود. آنگاه به آن پی در پی ۲ میلی لیتر محلول پتاسیم هگزاسیانو فرات (II) و ۲ میلی لیتر محلول استات روی افزوده شده و پس از هر افزایش بهم زده می شود. پس از سرد شدن، محتویات آن به یک بالن ژوژه ۲۰۰ میلی لیتری منتقل شده و به حجم رسانده می شود. محلول حاصل بهم زده شده و با کاغذ صافی صاف شده و اگر لازم باشد محلول صاف شده چند بار از همان کاغذ صافی عبور داده می شود تا کاملا صاف و شفاف شود.

۴-۴-۱٫ اندازه‏گیری: به وسیله پیپت، مقدار معینی از محلول صاف شده ( حداقل ۱۰ میلی لیتر ) به بالن ژوژه ۵۰ میلی لیتری منتقل شده و تقریبأ تا ۳۰ میلی لیتر با آب رقیق شده و به وسیله یک پیپت، مقدار ۵ میلی لیتر از محلول A و سپس ۳ میلی لیتر از محلول C به آن افزوده شده و کاملاً مخلوط می شود. این محلول باید در جای تاریک و در حرارت معمولی نگهداری شود. یک میلی لیتر از محلول B به آن افزوده شده و به خوبی مخلوط کرده و به مدت سه دقیقه در حرارت محیط در جای تاریک قرار داده می شود. بعد از گذشت ۱۵ دقیقه جذب این محلول با اسپکتروفتومتر یا بینات سنج، اندازه گیری می شود. میزان جذب محلول بلانک از مقدار جذب محلول نمونه کم شده و وزن نیتریت موجود در نمونه از روی منحنی استاندارد به دست آورده می شود.

• تهیه محلول بلانک: با بکارگیری ۱۰ میلی لیتر آب مقطر به جای محلول نمونه و انجام مراحل فوق الذکر، محلول بلانک تهیه می شود.
• تهیه منحنی استاندارد: در شش بالن‏ ژوژه ۵۰ میلی لیتری، به ترتیب مقادیر ۰٫۰، ۰٫۵، ۱٫۰، ۲٫۰، ۲٫۵ و ۳٫۰ میلی لیتر محلول استاندارد نیتریت سدیم و ۳۰, ۲۹/۵, ۲۹، ۲۸, ۲۷/۵ و ۲۷ میلی لیتر آب مقطر ریخته و طبق توضیحات فوق، عمل شود. با قرار دادن جرم نیتریت به میکروگرم در محلول‏های استاندارد، روی محور x و مقادیر جذب مربوطه روی محور y منحنی استاندارد رسم می شود.

 ۵-۱٫ محاسبات

مقدار نیتریت برحسب میلی گرم، در یک کیلوگرم یا یک لیتر فرآورده از روابط زیر برآورد می شود:

m₁ × (۲۰۰ / (V₁ × V₀)) و یا m₁ × (۲۰۰ / (V₁ × m₀))

که در آن

m₀ = جرم نمونه مورد آزمایش به گرم

m₁ = برابر است با جرم یون نیتریت (NO₂¯) به میکروگرم در حجم محلول صاف شده برداشتی که از روی منحنی استاندارد خوانده شده است.

_۰ V = برابر است با حجم نمونه مورد آزمایش به میلی لیتر

_۱ V = برابر است با حجم محلول صاف شده برداشته شده به میلی لیتر

2. اندازه گیری نیترات

اصول کار اندازه گیری نیترات، استخراج نمونه با آب داغ، ترسیب پروتئین‏ها با افزایش محلول پتاسیم هگزاسیانوفرات (II) و استات روی، صاف کردن محلول حاصل، احیای نیترات این محلول به نیتریت بوسیله کادمیوم فلزی، افزایش سولفانیل آمید کلرید و ان -( ۱- نفتیل) اتیلن دی آمید دی هیدروکلرید به محلول صاف شده و اندازه‏گیری کمپلکس قرمز رنگ ایجاد شده توسط نیتریت، در طول موج ۵۳۸ نانومتر به روش اسپکتروفتومتری است.

۱-۲٫ وسایل لازم

علاوه بر وسایل مشخص شده بند ۱-۲، همزن مکانیکی قائم و کاغذ صافی بدون نیتریت و نیترات برای آهسته صاف کردن.

۲-۲٫ مواد لازم (واکنشگرها)

• میله‏های روی به طول ۱۵۰ میلیمتر و قطر ۵ الی ۷ میلیمتر
• محلول سولفات کادمیوم: مقدار ۴۰ گرم سولفات کادمیوم ۸ آبه (CdSO₄.8H₂O) در یک بالن ژوژه ۲۰۰ میلی لیتری منتقل شده و با آب حل شده و به حجم رسانده می شود.
• در یک بشر باریک و بلند ۲۵۰ میلی لیتری که حاوی ۲۰۰ میلی لیتر محلول سولفات کادمیوم است، میله‏های روی در درون محلول به مدت یک ساعت قرار داده می شود، به طوری که محلول میله‏های روی را کاملاً بپوشاند و به طور منظم با اسپاتول کادمیوم‏های احیاء شده از روی میله روی تراشیده شده تا وارد محلول شود. با استفاده میله همزن شیشه‏ای کادمیوم را به صورت گرد نرم درآورده و کادمیوم جمع‏آوری شده از روی میله‏های روی یک بار با اسید کلریدریک ۰٫۱ مولار و چند بار با آب شسته شده و سپس به کار برده می شود. کادمیوم حاصل پودر شده و زیر آب نگهداری می شود.
• محلول بافر آمونیاک با پی اچ ۹٫۶: در یک بالن ژوژه ۱۰۰۰ میلی لیتری ۳۷٫۴ گرم کلرور آمونیوم (NH₄Cl) در ۹۰۰ میلی لیتر آب حل شده و pH آن با محلول آمونیاک غلیظ با چگالی ۰٫۸۸ گرم در میلی لیتر در دمای ۲۰ درجه سانتیگراد روی ۹٫۶ تنظیم شده و با آب به حجم رسانده می شود.

۳-۲٫ روش کار

آماده سازی نمونه آزمایشی و ایجاد محلول صاف شده مطابق آنچه در بند (۴-۱) بیان شده اجرا می شود.

۲-۳-۱٫ اندازه‏گیری: با یک پیپت مقداری از محلول صاف شده که بین ۳۰ تا ۱۲۰ میکروگرم یون نیترات (NO₃¯) داشته باشد (۱۰ میلی لیتر یا کمتر ) برداشته و به یک ارلن مایر ۲۵ میلی لیتری که قبلاً در آن حدود ۲ گرم کادمیوم و ۵ میلی لیتر محلول بافر ریخته شده است منتقل شده و درب آن بسته شده و با بهم زن مکانیکی قائم به مدت ۵ دقیقه همزده می شود. محلول با کاغذ صافی صاف شده و محلول شفاف در بالن ژوژه ۵۰ میلی لیتری جمع‏آوری شده و سپس ارلن مایر و صافی را چندین بار با مقادیر کم آب شست و شو داده و در همان بالن ژوژه جمع آوری شده و با آب مقطر به حجم رسانده می شود. سپس نیتریت کل را مطابق مطالب بیان شده برای نیتریت، با به کار گرفتن ۱۰ میلی لیتر محلول نمونه آزمایشی اندازه گیری می شود. میزان جذب محلول بلانک از آن کسر شده و مقدار نیتریت کل از روی منحنی استاندارد، تعیین می شود.

۲-۳-۲٫ آزمون محلول بلانک: با به کارگیری ۱۰ میلی لیتر آب مقطر به جای آزمونه آزمون محلول بلانک مطابق مشروحات فوق الذکر، انجام می شود.

۴-۲٫ محاسبات

مقدار یون نیترات (NO₃¯) در یک کیلوگرم یا یک لیتر فرآورده برحسب میلی گرم برابر است با:

یا

که در آن

_۲ m = مقدار یون نیتریت کل(NO₃¯) موجود برحسب میکروگرم در حجم (_۲ V) محلول صاف شده برداشته شده که از روی منحنی استاندارد خوانده شده است.

_۲ V = میلی لیتر محلول آزمونه برداشته شده برای اندازه‏گیری با اسپکتروفتومتر

_۳ V = میلی لیتر محلول صاف شده برداشته شده جهت تهیه محلول آزمونه m₀, m₁ و V₀و V₁ دارای همان مفاهیم ذکر شده هستند.

۱/۳۴۸ = نسبت بین جرم‏های مولکولی یون نیترات (NO₃¯) به یون نیتریت (NO₂¯) است.